細胞培養(yǎng)?咋培養(yǎng)?

    細胞培養(yǎng)，看似簡單的一個實驗，卻不知道把多少英雄豪杰折磨的意欲“自掛東南枝”。今天恒遠生物就為大家盤整理出了一篇養(yǎng)細胞的注意事項，養(yǎng)細胞可不同于養(yǎng)閨女，稍微磕磕碰碰，一切就重新來過！希望廣大科研汪能與細胞愉快的玩耍呦！

    （一）冷凍管應(yīng)如何解凍 

    取出冷凍管后，須立即放入 37 ℃ 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防冷凍管的爆裂。

    （二）細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，DMSO如何處理

    在細胞解凍之后，可直接離心去除DMSO，用新鮮的培養(yǎng)基懸浮后直接放入含有 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中進行細胞培養(yǎng)，如此可避免解凍后細胞生長受到DMSO影響。

    （三）可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基

    每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應(yīng)，造成細胞無法存活，不應(yīng)該馬上替換。 

    （四）可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類

    血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

    （五）何謂 FBS，F(xiàn)CS，CS，HS 

    FBS （fetal bovine serum） 和 FCS （fetal calf serum） 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清。CS （calf serum） 則是指小牛血清。HS （horseserum） 則是指馬血清。 

    （六）培養(yǎng)細胞時應(yīng)使用 5% 或 10% CO2 

    一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO₃^-/CO₃^2-/H⁺ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中 NaHCO₃ 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的 CO₂ 濃度。理論當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO₃ 含量為每公升 3.7 g 時，細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用 10% CO₂；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO₃ 為每公升 1.5 g 時，則應(yīng)使用 5% CO₂ 培養(yǎng)細胞。 

    （七）何時須更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中是否須添加抗生素。

    視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。 

    一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中可以添加抗生素。 按1％體積分數(shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 μ/mL。 

    (八）貼壁細胞傳代時所使用的trypsin-EDTA濃度及相應(yīng)處理

    一般使用的 trypsin-EDTA 濃度為0.25%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。*開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin的活性降低，并可減少污染的機會。

    （九）將一般動物細胞離心下來，離心速率多少

    回收動物細胞，其離心速率一般為1000 rpm，5-10 分鐘，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細胞死亡。 

    （十）細胞的接種密度 

    依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。

    （十一）細胞冷凍培養(yǎng)基的成分及DMSO的等級

    動物細胞冷凍保存時常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5-10% DMSO （dimethyl sulfoxide） 和 90~95 % 原來細胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合。注意：由于 DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將 DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO ，其本身即為無菌狀況，首次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中避光保存。

    （十二）冷凍保存細胞的方法及冷凍細胞濃度

    將貼壁細胞消化后離心收集，懸浮細胞直接離心收集，以含有DMSO*培養(yǎng)基或胎牛血清的凍存液重懸細胞至終濃度約1x106/ml。。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過夜。次日保存到液氮中。 

    冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

    （十三）如何避免細胞污染

    細胞污染的種類可分成細菌、真菌、霉菌、病毒等。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細胞等。嚴格無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的方法。

    （十四）支原體 （mycoplasma）污染的細胞， 對細胞培養(yǎng)有何影響

    不能以肉眼觀察出支原體污染異狀。除極有經(jīng)驗的專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨。

    支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數(shù)，代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為 mycoplasma-free，實驗結(jié)果的數(shù)據(jù)方有意義。

    （十五）培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中，顏色會偏暗紅色，且 pH 值會越來越偏堿性

    培養(yǎng)基保存于4 ℃冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾 CO2 ，以調(diào)整 pH 值。或酸堿調(diào)PH。

    （十六）L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

    L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

    （十七）什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

    酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 

    丙酮酸鈉可以作為細胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。 

    更多精彩內(nèi)容，可關(guān)注“恒遠生物”*VX公眾號獲取更多精彩資訊！