很多人第一次做ELISA實(shí)驗，覺得真簡單，無非就是加樣，保溫，洗滌等操作步驟。可是第二次做ELISA實(shí)驗，實(shí)驗結(jié)果怎么差那么多？同一份樣本怎么可能呢？第三次做ELISA，決定認(rèn)真一些，實(shí)驗結(jié)果還是不盡人意，誒，也太難了！今天小編就給大家總結(jié)一下ELISA實(shí)驗要點(diǎn)，掌握這些，實(shí)驗So easy！
ELISA實(shí)驗操作注意要點(diǎn)
一、加樣
在 ELISA 中除了包被外，一般需進(jìn)行 4－5 次加樣。在定性測定中有時不強(qiáng)調(diào)加樣量的準(zhǔn)確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此時應(yīng)該使用相同口徑的滴管，保持準(zhǔn)確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應(yīng)力求準(zhǔn)確。標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制。加樣時應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡。
1. 吸取樣品時，加樣槍吸頭不應(yīng)黏附多余的液體；加樣時不可90度向孔中滴加液體，這樣會導(dǎo)致液體殘留在吸頭上，加樣不準(zhǔn)確！
2. 不要將吸頭伸入孔中，一方面若接觸孔底可能壓彎吸頭，另一方面可能會將孔中的液體吹起來，加樣不準(zhǔn)確！
3.正確的加樣方法應(yīng)為45度，吸頭貼著孔壁加入，應(yīng)注意：
①角度太小，會使液體殘留在孔壁上，導(dǎo)致加樣不準(zhǔn)確！
②吸頭應(yīng)當(dāng)貼著管壁和液面的交界處！
二、保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。
ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。
在 ELISA 中一般有二次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本后和加結(jié)合物后，此時反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各 ELISA 板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。濕盒應(yīng)該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。加入底物后，反應(yīng)的時間和溫度通常不做嚴(yán)格要求。如室溫高于 20℃，ELISA 板可避光放在實(shí)驗臺上，以便不時觀察，待對照管顯色適當(dāng)時，即可終止酶反應(yīng)。
三、洗滌
洗滌在 ELISA 過程中不是反應(yīng)聚，但卻是決定實(shí)驗成敗的關(guān)鍵。洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。因此在 ELISA 測定的反應(yīng)過程中應(yīng)盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在標(biāo)本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）一類物質(zhì)即右達(dá)到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號，結(jié)合月桂酸的為聚山梨酯 20，在 ELISA 中為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強(qiáng)抗原抗體結(jié)合的作用。
洗滌如不*，特別在后一次，如有酶結(jié)合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標(biāo)本內(nèi)的非特異性 IgG 吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標(biāo)抗體作用而產(chǎn)生干擾。
ELISA 板的洗滌一般可采用以下方法：
①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液；
②將洗滌液注滿板孔；
③放置 2 min，略作搖動；
④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為 3～4 次，有時甚至需洗 5～6 次。
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