細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟

 

 細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

 

細(xì)胞凋亡檢測(cè)可以：

（1）用于腫瘤細(xì)胞和組織在內(nèi)的不同種類(lèi)病理標(biāo)本研究；

（2）應(yīng)用于臨床診療，新藥研制、生物制品開(kāi)發(fā)、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療；

（3）對(duì)相關(guān)疾病的早期發(fā)現(xiàn)、放化療的療效評(píng)價(jià)具有舉足輕重的地位。

實(shí)驗(yàn)方法原理

本實(shí)驗(yàn)用1μg/ml 三尖杉酯堿HT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時(shí)也有少數(shù)細(xì)胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細(xì)胞。

 

三尖杉酯堿（HT）是我國(guó)自行研制的一種對(duì)急性粒細(xì)胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時(shí)，即可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。

細(xì)胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過(guò)質(zhì)膜。當(dāng)細(xì)胞壞死時(shí)，質(zhì)膜不完整，PI就進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細(xì)胞著色，凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞不著色。而一些活細(xì)胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進(jìn)入活細(xì)胞，因而可進(jìn)行活細(xì)胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。凡是看到有凋亡小體的細(xì)胞都是凋亡細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、試劑準(zhǔn)備

 

1.  三尖杉酯堿（HT）：300μg/ml；

 

2.  Tris-HCl（pH7.5）：100mmol/L；

 

3.  EDTA緩沖液：5mol/L；

 

4.   堿性裂解液：0.2mol/L NaOH；

 

5.        醋酸鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；

注意事項(xiàng)

1.  誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞時(shí)間要準(zhǔn)確；

 

2.  熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞時(shí)，由于熒光易碎滅，觀察時(shí)要盡量快。