羅丹明123染色步驟解析

上海恒遠(yuǎn)生物供應(yīng)的熒光染料羅丹明123（Rh123）是一種可對(duì)活細(xì)胞線粒體染色的細(xì)胞染色試劑。Rh123可透過(guò)細(xì)胞膜且在活細(xì)胞的線粒體內(nèi)聚集，并發(fā)出黃綠色熒光。Rh123用于對(duì)許多種細(xì)胞進(jìn)行染色，包括植物細(xì)胞和細(xì)菌。由于細(xì)胞內(nèi)ATP的量與Rh123的熒光強(qiáng)度之間有相關(guān)性，此熒光染料被應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ATP。Rh123還用于癌癥研究。

Rhodamine 123 染色
中文名稱：羅丹明 123
目    的：測(cè)細(xì)胞內(nèi)線粒體的跨膜電位
EX/EM：  505/534
染液配制： 羅丹明123 粉劑用甲醇配制成1mg/ml的儲(chǔ)備液，100ul/支分裝，-20℃保存。染色時(shí)用Dulbecco’s PBS緩沖液將其稀釋為5ug/ml。
 說(shuō)明：激光染料，生物染色。

別名：；2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-

yl)benzoic acid methyl ester

外觀：紅色至棕色粉末溶解性：溶于水。溶于乙醇，參考濃度1mg/ml。

英文名：Rhodamine

是一種熒光染

說(shuō)明：激光染料，生物染色。

別名：；2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-

yl)benzoic acid methyl ester

外觀：紅色至棕色粉末

溶解性：溶于水。溶于乙醇，參考濃度1mg/ml。

英文名：Rhodamine

是一種熒光染料，鄰苯二酚類料，鄰苯二酚類

染色步驟：
培養(yǎng)細(xì)胞

Dulbecco’s PBS緩沖液漂洗2～3次(緩沖液預(yù)熱至室溫或37℃) 

Rhodamine 123(5ug/ml) 37℃孵育1小時(shí)

Dulbecco’s PBS緩沖液漂洗2～3次 

加0.5ml Dulbecco’s PBS，上機(jī)測(cè)量

Fluo-3-AM 染色 (測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度)
原理：
AM酯的羧酸經(jīng)修改不帶電荷，易浸入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞，親脂性集團(tuán)被非特異酯酶切斷，使其帶電荷，從而溢出細(xì)胞大大減慢。一般，酯化集團(tuán)水解對(duì)于結(jié)合靶離子是必須的。AM酯水解顯顏色或熒光的特點(diǎn)可用于檢查其自發(fā)水解。

保存：
指示劑干燥避光4℃或-20℃可長(zhǎng)期保存。
AM酯易水解，發(fā)貨瓶中至少可放六個(gè)月。
用時(shí)AM應(yīng)溶解于無(wú)水DMSO，并盡快使用（一周內(nèi)），否則細(xì)胞運(yùn)載能力下降。AM的DMSO儲(chǔ)備液應(yīng)避光、冷凍、干燥保存。鹽的儲(chǔ)備液應(yīng)用蒸餾水或緩沖液制備，冷凍-20℃避光保存，可放6個(gè)月。
應(yīng)用：
用細(xì)胞浸透AM酯運(yùn)載技術(shù)：
1.在生理緩沖媒介中將DMSO稀釋至1-5μM。不可用含胺的緩沖液如Tris。
2.有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑苯甲酸（1－2.5mM）或sulfinpyrazone(0.1-0.25mM)可加入細(xì)胞外液以減少指示劑去酯后的滲漏。苯甲酸和sulfinpyrazone是很堿性的，所以之后要重調(diào)pH值。
3.AM酯孵育細(xì)胞一般在20－37℃，15－60分鐘，準(zhǔn)確的濃度，時(shí)間和溫度靠經(jīng)驗(yàn)摸索。AM酯運(yùn)載技術(shù)有一個(gè)內(nèi)在問(wèn)題即亞細(xì)胞隔閡，降低孵育溫度可以減輕這一副作用。
4.檢測(cè)熒光前，建議細(xì)胞在無(wú)指示劑媒介中（有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑）洗，以去掉細(xì)胞表面的非特異吸附的染料。而后再孵育30分鐘來(lái)進(jìn)一步使細(xì)胞內(nèi)AM酯*脫掉。熒光素泄漏引起的背景高可以在實(shí)驗(yàn)前在細(xì)胞外加入抗熒光素抗體來(lái)防止。
目    的：測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度
EX/EM：探針在細(xì)胞外液無(wú)熒光，進(jìn)入細(xì)胞后zui大激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)為464/526

方法一：
染液配制：Fluo-3-AM 50ug溶于45ul DMSO(Fluo-3-AM濃度 1mM)，15ul/支分裝，-20℃保存。染色時(shí)用15～50mM HEPES緩沖液將其稀釋為1～20uM(如1.5ml 為10uM)。
染色步驟：
培養(yǎng)細(xì)胞

緩沖液漂洗2～3次 

Fluo-3-AM (1～20uM) 37℃或室溫孵育0.5～1小時(shí)

緩沖液漂洗2～3次 

加0.5ml 緩沖液，上機(jī)測(cè)量

上海恒遠(yuǎn)供應(yīng)產(chǎn)品參數(shù)：羅丹明123 1 WinID:0UNV 中文名稱:羅丹明123 英文名稱:Rhodamine 123 別名名稱:2-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)benzoic acid methyl ester